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PARASITOLOGIE Direktnachweis
Legionella Pneumophila
Direkter Immunfluoreszenz-Nachweis für Legionella pneumophila (DFA Test)
Kat. Nr. BR 201
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ANWENDUNG
Dieser Test ist ein in vitro Direktnachweis von Legionella pneumophila aus klinischen Abstrichen und Bakterienkolonien
auf Nährböden.
BACKGROUND
Legionella pneumophila, ein gramnegatives Bakterium, wurde isoliert als äthiologisches Agenz der
Legionärskrankheit (einer akuten Pneumonie ) und Pontiac-Fieber (einer nicht-pneumonischen, selbst limitierenden
respiratorischen Infektion) (1,2). Seit dem ersten Bericht einer Isolierung des Erregers der Legionärskrankheit
im Jahre 1977, wurden verschiedene Serogruppen / Serotypen beschrieben (zuletzt 16 von L. pneumophila und andere Spezies
des Genus Legionella). Die jeweiligen Stämme für L. pneumophila und für die anderen Legionella Species
wurden aus der Umwelt isoliert. Aber nicht alle Legionella-Stämme sind bei Erkrankungen des Menschen involviert. Die
meisten Publikationen zeigen, daß die Mehrzahl der klinischen Isolate der Serogruppe 1 von L. pneumophila
angehört. Wegen der Anzüchtungsschwierigkeiten von L. pneumophila aus klinischen und Umweltproben auf
geeigneten Nährböden, wurden immunologische Nachweisverfahren entwickelt, um L. pneumophila mit ihren
antigenen komplexen Systemen identifizieren und serologisch typisieren zu können (3,4). Ebenso sind die
immunologischen Reagenzien mit konventionellen polyklonalen Antikörpern in ihren Möglichkeiten limitiert.
Deshalb werden monoklonale Antikörper aus Maus-Hybridomazellen verwendet, die spezifisch mit den relevanten
Antigendeterminanten von L. pneumophila reagieren können. Mit diesen monoklonalen Antikörpern gelang es
standardisierte Reagenzien für den spezifischen Nachweis und Identifikation dieser Bakterien herzustellen (5,8).
Der Immunfluoreszenz-Direktnachweis (DFA Verfahren) für L. pneumophila verwendet monoklonale L. pneumophila
Antikörper, die mit Fluorescein-isothiocyanat (FITC) konjugiert sind. Dieses immunologische Färbereagenz
ermöglicht den Nachweis aller bekannten Serogruppen von L. pneumophila aus klinischen Abstrichen und
akterienkulturen.
TESTPRINZIP
Klinische Abstriche oder Abstriche aus Nährbodenkolonien werden mit FITC-konjugierten anti-L. pneumophila
Färbereagenz behandelt. Die konjugierten, monoklonalen Antikörper aus dem Färbereagenz binden sich
hierbei spezifisch an die Bakterien (falls vorhanden) und bilden so Antigen-Antikörper-Komplexe mit dem
Abstrichmaterial aus. Nach einem Waschschritt können die Antigen-Antikörper-Komplexe mit einem
Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Man erkennt leuchtende, apfelgrüne fluoreszierende Bakterien
(Bacilli oder Coccobacilli). Der Hintergrund oder andere eventuell vorhandene Bakterien aus dem Abstrich zeigen
eine orange bis rote Gegenfärbung.
PACKUNGSINHALT
Der Kit enthält ausreichend Reagenzien für 2 x 96 Bestimmungen.
| 1 x 1ml |
gebrauchsfertiges Färbereagenz in Puffer mit Protein, Evan`s -Blau und Konservierungsmittel
(FITC-konjugierte mausmonoklonale Antikörper gegen L. pneumophila) Das Reagenz reicht für ca 50 Bestimmungen). |
| 1 x 1ml |
positives Kontrollantigen (inaktivierte Bakteriensuspension) |
| 1 x 3 ml |
Eindeckmittel (gepuffertes Glycerin) |
| 25 Stck |
Mikroskop-Objektträger |
| 25 Stck |
Transferpipetten |
| 25 Stck |
Deckgläser |
| 1 Stck |
Arbeitsanleitung |
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IM KIT NICHT VORGESEHENES MATERIAL
- Fluoreszenzmikroskop (Filtersystem für FITC)
- Brutschrank für 37°C
- Feuchtigkeitskammer (abgedeckte Petrischale mit feuchtem Filterpapier auf dem Boden)
- Formalin (1 %ig in Kochsalzlsg.)
- Sputolysin (Behring Diagnostika) oder Dithiothreitol (Sigma)
- Waschflasche und / oder Färbeküvette
AUFBEWAHRUNG UND HALTBARKEIT
Die Haltbarkeit des Testkits ist auf dem Außenetikett angegeben. Der Kit wird bei 2°-8°C aufbewahrt. Das
gebrauchsfertige Färbereagenz kann für längere Zeit auch bei -20°C eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren
und Auftauen ist zu vermeiden. Vor jeder Anwendung wird das Reagenz auf mikrobielle Kontamination überprüft.
PROBEMATERIAL
Klinische Proben (Sputum, Bronchial-Lavage, Lungengewebe) werden entsprechend den
Standardvorschriften entnommen und gesammelt. Sie müssen sorgfältig bearbeitet werden, da Gefahr bestehen könnte,
daß das Untersuchungsmaterial HIV-kontaminiert ist. Frische oder frisch eingefrorene Proben können für den
Direktnachweis verwendet werden.
ABSTRICHPRÄPARATE
- Respiratorische Flüssigkeiten: Direkte Abstriche von Sputumproben werden auf einer
Objektträgerauftragstelle mit Hilfe eines sterilen Abstrichtupfers angefertigt. (Fortfahren mit der Färbeprozedur)
- Viskoses Sputummaterial wird mit Dithiothreitol oder Sputolysin entsprechend den
Standardmethoden verflüssigt. Verflüssigte Sputumproben werden erst 5 min bei 1500 x g zentrifugiert und davon
1-2 Tropfen der Boden nahen Schicht auf einer Auftragsstelle eines Objektträgers mit einer Transferpipette
plaziert und ausgebreitet. (Fortfahren mit der Färbeprozedur).
- Proben aus Bronchialwaschungen oder -Lavage werden zuerst durch
Zentrifugation (1500 x g / 10 min) aufkonzentriert. Der Überstand bis auf einen Rest verworfen (0,5 ml). Das
Sediment wird darin resuspendiert. 1-2 Tropfen Suspension mit einer Transferpipette auf das Auftragsfeld eines
Objektträgers plazieren und verteilen (Fortfahren mit der Färbeprozedur).
Organismen aus Bakterienkultur
Verdächtige Bakterienkolonien mit einer Impföse aus der Kulturplatte entnehmen und in einem Volumen von 0,5 ml an
1%igem Formalin in physiologischer Kochsalzlösung suspendieren. 1-2 Tropfen dieser Suspension auf eine Auftragstelle
eines Objektträgers mit einer Transferpipette überführen und ausbreiten. Die überstehende Flüssigkeit mit der
Transferpipette absaugen und verwerfen (Fortfahren mit der Färbeprozedur).
Kontrollantigen
Das im Testkit mitgelieferte positive Kontrollantigen gut durchmischen. 1-2 Tropfen dieser Suspension auf die
Auftragstelle eines Objektträgers mit einer Transferpipette überführen und ausbreiten. Den überstehenden
Flüssigkeitsrest mit der Transferpitte absaugen und verwerfen. Diese Kontrolle muß bei jedem Test mitgeführt
werden (Fortfahren mit der Färbeprozedur).
Beachte
Getrennte Objektträger und neue Transferpipetten für die Ausstriche von individuellen klinischen Proben verwenden. Von
jeder Probe doppelte Ausstriche anfertigen. Positives Kontrollantigen mit eigener Pipette auf eigener Auftragstelle
ansetzen. Falls das positive Kontrollantigen keine Fluoreszenz aufweist,.kann der Nachweis nicht ausgewertet
werden und ist zu wiederholen.
FÄRBEPROZEDUR
- Probenausstriche an der Luft trocknen lassen und Hitze fixieren durch schnelles Bewegen der Objektträger durch
eine Flamme.
- Auf die abgekühlten Objektträger 15-20 µl Färbereagenz (monoklonale anti-L. pneumophila Antikörper
FITC konjugiert) auf Testproben und Kontrollantigen geben.
- Objektträger in einer feuchten Kammer 30 min bei 37°C inkubieren. Den Reagenzüberschuß absaugen oder
den Objektträger mit einem Filterpapier abtupfen (den Objektträger nicht austrocknen lassen).
- Mit einer Waschflasche mit mildem Strom Aqua dest. den Objektträger abspülen. Alternativ 2 x 5 min in
einer Färbeküvette mit Aqua dest. waschen. Überschuß Waschflüssigkeit durch Abtupfen des Objektträgers
mit einem sauberen Papierhandtuch entfernen und das Präparat an der Luft trocknen lassen.
- Mit Eindeckmittel (1-2 Tropfen) ein Deckglas einbetten.
- Jede Auftragstelle unter dem Fluoreszenzmikroskop zuerst mit einer Vergrößerung von 25 x 40 und
dann mit 63 x 100 untersuchen, um die Morphologie der Bakterien zu identifizieren.
Anmerkung: Der Objektträger muß sofort untersucht oder bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt
werden; innerhalb von 24-48 Stunden ablesen.
VORSICHTSMASSNAHMEN
- Alle Reagenzien sind nur für den in vitro Gebrauch.
- Färbereagenz nicht direktem Tageslicht aussetzen.
- Alle Reagenzien müssen vor Gebrauch Zimmertemperatur (20-25°C) erreicht haben. Nach Gebrauch sofort in den Kühlschrank stellen.
- Vor Gebrauch Objektträger mit 95%igen Äthanol reinigen.
- Schutzhandschuhe während des Tests benutzen.
- Reagenzfläschchen vor Gebrauch schütteln.
- Das Färbereagenz enthält Evan`s-Blau, welches ein potentielles Karzinogen darstellt. Vermeide Hautkontakt. Sofort abwaschen, wenn man damit in Berührung gekommen ist.
- Keine Kitkomponenten über das Verfallsdatum hinaus verwenden
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Zeigen Präparate einzelne Bakterien oder Anhäufungen (variabel in der Größe) von apfelgrünen Coccobacilli oder von
stäbchenförmigen Bakterien. Diese Färbung gilt als positiver Nachweis von L. pneumophila. Die Organismen müssen
fluoreszeieren und entsprechende morphologische Charakteristika ähnlich der der positiven Kontrolle aufweisen. Eine
Probe, die orange bis rot gefärbte Organismen zeigt, gilt als negativ auf L. pneumophila. Bei Bakterien aus
Nährbodenkolonien können die Fluoreszenzintensitäten variieren. Dies hängt von der Bakteriendichte, aber auch vom
Alter der Kultur ab.
TESTBEGRENZUNGEN
- Die Abwesenheit von L. pneumophila in einer klinischen Probe muß nicht die Existenz anderer Legionella Spezies ausschließen.
- Einige Bakterien, wie Staphylococus aureus und einige wenige andere Bakterienspezies tragen Fc-Rezeptoren für IgG auf ihren Zellwänden. Diese weisen dann eine Fluoreszenz aufgrund einer unspezifischen Bindung von Gammaglobulinen an den Fc-Rezeptoren ihrer Zelloberfläche auf.
- Die Anwesenheit von Leukozyten im Probenmaterial stört die Interpretation, da diese Zellen ebenfalls Fc-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche aufweisen.
- Antibiotikabehandlung eines Patienten vor der Probenmaterialgewinnung zeigt sich in einer Änderung der morphologischen Struktur.
LITERATUR
- McDade, J.E., Shepard, C.C., Fraser, D.W. et al, 1977. Legionnnaire`s disease: Isolation of a bacterium and demonstration of its role in another respiratory disease. N. Engl. J Med, 297, 1197-1203.
- Fraser, D.W., Deubner, D.C., Hill, D.L:, and Gilliam, D.K. 1979. Non pneumonic short-incubation period legionellosis (Pontiac fever) in men who cleaned a steam turbine condensor. Science (Washington, D.C.) 205, 5690-5691
- Collins, M.T., Cho, S.N., Hoiby, N., et al, 1983. Crossed immunoelectrophoretic analysis of Legionella pneumophila serogroup 1 antigens. Infect. Immun. 39, 1428-1440.
- Joly, J.R., and Kenny, G.E. 1982. Antigenic analysis of Legionella pneumophila and Tatlockia micdadei (Legionella midadei) by two dimensional (crossed ) immunoelectrophoresis. Infect. Immun. 35, 721-729.
- Guillet, J.G., Hoebeke, J., Tram, C., et al, 1983. Characterization, serological specificity and diagnostic possibilities of monoclonal antibodies against Legionella pneumophila. J Clin. Microbiol. 18, 793-797.
- Sethi, K.K., 1985. Monoclonal antibodies against Legionella pneumophila Serogroup 1 antigens: Characterization and their potential applications. p. 121-136, In A.J.L. Macario and Everly C. de Macario (ed.) Monoclonal antibodies against bacteria . Academic Press, Inc. New York, Vol. 1.
- Jolly, J.R.; Chen, Y.Y., and Ramsay, D. 1983. Serogrouping and subtyping of Legionella pneumophila with monoclonal antibodies. J. Clin. Microbiol. 18,1040-1046.
- Gostig, L.H., Cabrian, K., Starge, J.C. and Goldstein, L.C. 1984. Monoclonal antibody to a species specific antigen of Legionella pneumophila. J. Clin. Microbiol. 20, 1031-1035.
(01.07.2005)
Arbeitsanleitung Legionella Pneumophila als PDF zum Download (107 kb)
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